Phân lập bộ gen DNA từ máu toàn phần
Phân lập bộ gen DNA từ máu toàn phần
CHU Nantes-Hotel Dieu, Viện Sinh học, Phòng thí nghiệm Huyết học – Sinh học Phân tử, Nantes, Pháp
Nadia Boujtita, Tiến sĩ, Thermo Fisher Scientific, Saint-Herblain, Pháp
Mở đầu
Việc thu thập bộ gen DNA có trọng lượng phân tử tinh sạch lớn từ máu toàn phần hoặc nuôi cấy tế bào là bước khởi đầu quan trọng để các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu tiếp theo như khuếch đại PCR hoặc phân hủy giới hạn. Trong phương thức này, DNA có độ tinh sạch cao được thu thập từ lớp buffy coat (bao gồm bạch cầu và tiểu cầu) của máu người từ 10 bệnh nhân để phân tích tiếp. Cùng với việc sử dụng bộ Nucleon® BACC2, kết quả DNA được phân tích để chứng minh nồng độ và độ tinh sạch có thể chấp nhận được bằng máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific .
Các bộ thử nghiệm có sẵn, chẳng hạn như Nucleon BACC2 của GE® Health Care Europe-Amersham giúp giảm thiểu nhu cầu về thuốc thử và hàng tiêu hao. Người sử dụng chỉ cần trang bị máy ly tâm lạnh và pipet chất lượng cao để hoàn tất quá trình tách chiết.
Hình 1: Máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific microcentrifuge.
Điều quan trọng là phải tìm được hệ thống tách chiết DNA và sử dụng thiết bị phù hợp để đáp ứng các ứng dụng tiếp theo, bao gồm ứng dụng enzyme và tổng hợp cDNA.
Máy ly tâm lạnh của Thermo Scientific là thiết bị lý tưởng để sử dụng cùng các bộ tách chiết DNA, ví dụ như bộ Nucleon BACC2..
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Mẫu máu người được thu thập từ 10 bệnh nhân. DNA được chiết xuất từ lớp buffy coat, theo hướng dẫn đi kèm với bộ Nucleon BACC2 của GE Health Care Europe-Amersham. Quy trình được mô tả trong bài viết ứng dụng này là bản tóm tắt quy trình có trong sách hướng dẫn sử dụng do nhà sản xuất cung cấp.
Vui lòng tham khảo thêm hướng dẫn sử dụng bộ sản phẩm để biết thông tin chi tiết về sản phẩm và các quy trình.
Tất cả các bước ly tâm được thực hiện bằng máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific tiêu chuẩn tại 4°C.
Quy trình
Phá vỡ màng tế bào
- Trong ống ly tâm 1,5 ml, tái huyền phù 400 µl buffy coat trong 1 ml dung dịch A (natri peclorat).
- Thu sinh khối tế bào bằng máy ly tâm vi mô lạnh ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút tại 4°C.
- Loại bỏ phần nổi phía trên và tái huyền phù sinh khối tế bào 2 hoặc 3 lần trong 700 µl dung dịch A (natri perchlorate). Khử protein bằng natri perchlorate
- Loại bỏ phần nổi phía trên và tái huyền phù sinh khối tế bào trong 500 µl thuốc thử B (chloroform) bằng máy lắc vortex.
- Thêm 125 µl natri perchlorate và đảo ngược ống vài lần. Chiết bằng cloroform và nhựa Nucleon
- Thêm 500 µl cloroform và đảo ngược ống trong 20-30 giây.
- Thêm 150 µl Nucleon silica và ly tâm ở tốc độ 6500 vòng/phút bằng máy ly tâm vi mô lạnh trong 3 phút tại 4°C
Kết tủa DNA
- Chuyển pha trên (500 µl) sang ống 1,5 ml mới và kết tủa DNA bằng 2 thể tích ethanol tuyệt đối lạnh.
- Ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific trong 10 phút tại 4°C.
Rửa DNA
- Rửa DNA bằng 1 ml ethanol lạnh 70%.
- Thu sinh khối DNA một lần nữa, ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific trong 10 phút.
- Để khô tự nhiên và hòa DNA vào đệm TE.
Đánh giá độ tinh sạch của axit nucleic
Các phép đo mật độ quang được sử dụng để phân tích nồng độ DNA và kiểm tra độ nhiễm bẩn của muối, dung môi và protein. DNA chiết xuất được đánh giá độ tinh sạch với tỷ lệ độ hấp thụ được xác định ở bước sóng 260 nm/230 nm (các chất gây ô nhiễm DNA/Hữu cơ hoặc carbohydrate như phenol và các hợp chất thơm khác) và 260 nm/280 nm (DNA/protein). (Nồng độ điển hình là 200-400 µg DNA với tỷ lệ 260/280 là 1,8 đến 2.)
Kết quả
Đánh giá độ tinh sạch DNA
Các phép đo mật độ quang được thực hiện sau khi chiết DNA bằng bộ Nucleon BACC2 và máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific. Tỷ lệ OD 260/280 từ 1,8 đến 2 và tỷ lệ OD 260/230 bằng 1,8 hoặc cao hơn cho thấy thu được DNA có chất lượng tốt (xem Bảng 1, Hình 2). DNA tinh khiết sau đó đã sẵn sàng cho các quá trình tiếp theo.
Hình 2. DNA được phân lập từ máu người bằng bộ dụng cụ Nucleon và sử dụng máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific. DNA được tách trên gel agarose 1%. Làn 1 gồm các dấu trọng lượng phân tử l x Hind III, làn 2-7 là các mẫu.
| Sample ID | Quantity ng/µl | OD 260/280 | OD 260/230 |
| Patient 1 | 476.71 | 1.87 | 2.11 |
| Patient 2 | 534.07 | 1.88 | 1.96 |
| Patient 3 | 546.04 | 1.88 | 1.83 |
| Patient 4 | 791.17 | 1.92 | 1.84 |
| Patient 5 | 805.83 | 1.91 | 1.90 |
| Patient 6 | 611.87 | 1.89 | 1.80 |
| Patient 7 | 695.31 | 1.90 | 1.83 |
| Patient 8 | 533.25 | 1.87 | 1.88 |
| Patient 9 | 562.41 | 1.87 | 1.84 |
| Patient 10 | 648.24 | 1.90 | 1.83 |
Bảng 1. Kết quả đo mật độ quang thu được sử dụng bộ Nucleon BACC2 và máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific.
Kết luận
DNA nồng độ cao, độ tinh sạch cao được lấy từ máu người bằng hệ thống bộ kit Nucleon BACC với máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific. DNA được điều chế theo cách này sẵn sàng để được phân hủy bằng các enzyme cắt giới hạn và được sử dụng để lập hồ sơ DNA và PCR thời gian thực.
Máy ly tâm vi mô lạnh Thermo Scientific thân thiện với người dùng đã được chứng minh là có hiệu quả vượt trội trong nhiệm vụ làm lạnh ổn định, liên tục và được khuyến nghị cho tất cả các phòng thí nghiệm sử dụng các phương pháp tiêu chuẩn hoặc bộ công cụ để phân lập bộ gen hoặc các quy trình khác.
Tài liệu tham khảo
GE Health Care Europe-Amersham; Product Codes RPN 8501, 8502 or 8512; Nucleon BACC, Genomic DNA from Blood and Cell Cultures publication number 18-1146-65, Rev 1.
Cần hỗ trợ thêm thông tin, Quý khách vui lòng liên hệ:
Ms. Lê Thị Thùy Trang, Phòng Marketing, DKSH.
📞 Điện thoại: (+84) 906 654 815
✉ Email: tecinfo.vn@dksh.com
Hoặc để lại thông tin như form bên dưới:
