Nghiên cứu đã làm sáng tỏ động lực nhân lên, khả năng thích ứng và tế bào học của virus SARS-CoV-2. Khi hội chứng hô hấp cấp tính nặng do virus Corona 2 (SARS-CoV-2) xuất hiện vào cuối năm 2019, các nhà nghiên cứu đã cố gắng tìm cách ngăn chặn đại dịch. Một khía cạnh quan trọng được nghiên cứu là cách virus nhân lên trong tế bào chủ. Ogando và cộng sự [1] đã nghiên cứu sự nhân lên của virus trong các tế bào Vero E6 bị nhiễm bệnh bằng kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang. Các kháng thể chống lại virus SARS-CoV trước đây cho thấy phản ứng chéo mạnh mẽ với SARS-CoV-2.

Kính hiển vi quan sát sự nhân lên của virus

Virus có thể được nghiên cứu với sự trợ giúp của một số kỹ thuật kính hiển vi. Tùy thuộc vào độ phóng đại và độ phân giải của kính hiển vi, việc quan sát có thể ở cấp độ mô, tế bào hoặc virion (Hình 1). Thông thường, bản thân virion chỉ có thể được phân giải bằng kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi siêu phân giải. Ở cấp độ tế bào, virus chủ yếu được quan sát bằng kính hiển vi đồng tiêu hoặc huỳnh quang trường rộng tiên tiến. Đối với mô, kính hiển vi trường sáng hoặc kính hiển vi huỳnh quang trường rộng cơ bản có thể đủ cho nghiên cứu virus. Nhưng việc phân biệt các kỹ thuật kính hiển vi không được thực hiện một cách chặt chẽ.

Các công cụ xử lý hình ảnh quang-kỹ thuật số, chẳng hạn như Computational Clearing [2], có thể giúp cải thiện tỷ lệ tín hiệu trên nền và giảm hiện tượng nhòe ngoài tiêu cự. Việc tăng cường độ tương phản liên quan có thể tiết lộ thông tin bổ sung trong hình ảnh kính hiển vi.

Hình 1: Virus có thể được quan sát ở các cấp độ khác nhau, từ toàn bộ mô đến một virion. Đối với phương pháp này, độ phóng đại và độ phân giải riêng biệt là cần thiết. Kết quả là, các nhà nghiên cứu chọn một kỹ thuật kính hiển vi phù hợp với nhu cầu của họ.

Miễn dịch huỳnh quang của protein virus

Trong số các kỹ thuật giải trình tự, tin sinh học và kính hiển vi điện tử, Ogando et al. [1] đã phân tích các tế bào bị nhiễm bệnh bằng kính hiển vi huỳnh quang: Các tế bào Vero E6 được nuôi cấy trên các phiến kính, các tế bào này bị nhiễm SARS-CoV-2 và được cố định bằng paraformaldehyde. Sau đó, các tế bào được ủ với kháng huyết thanh từ thỏ hoặc chuột đã tiếp xúc với SARS-CoV trước đó (Hình 2). Các kháng thể có nguồn gốc từ SARS-CoV, liên kết với cấu trúc SARS-CoV-2 trong tế bào Vero E6, sau đó được phát hiện bằng các kháng thể thứ cấp có nhãn huỳnh quang. Ngoài ra, nhân tế bào được nhuộm bằng Hoechst. Hình ảnh huỳnh quang được thực hiện với kính hiển vi huỳnh quang soi thẳng Leica DM6 B.

Hình 2: Một trong những thí nghiệm của Ogando et al. [1] liên quan đến việc sử dụng kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang để chụp ảnh các tế bào Vero E6. Về nguyên tắc, họ đã khám phá tiềm năng của kháng huyết thanh được tạo ra để chống lại SARS-CoV ở thỏ hoặc chuột trong đợt bùng phát năm 2002 và 2003. Họ đã sử dụng các kháng huyết thanh khác nhau của thỏ làm bộ kháng thể đầu tiên. Sau đó, những kháng huyết thanh này của thỏ được dán nhãn bằng bộ kháng thể thứ hai có huỳnh quang. Sau đó, quan sát huỳnh quang được thực hiện với kính hiển vi DM6 B.

Kháng thể SARS-CoV phản ứng chéo với SARS-CoV-2

Kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang cho thấy phản ứng chéo của nhiều kháng thể SARS-CoV trong các tế bào bị nhiễm SARS-CoV-2 (protein virus nsp3, nsp4, nsp5, nsp8, nsp9, nsp13, nsp15, N, M). Thực tế này có nghĩa là kháng huyết thanh được tạo ra chống lại SARS-CoV cũng dẫn đến nhuộm huỳnh quang đặc trưng trong các tế bào bị nhiễm SARS-CoV-2 (Hình 3). Trong khi các protein nsps được tìm thấy ở vùng quanh nhân của các tế bào bị nhiễm bệnh thì protein N lại lan rộng khắp bào tương. Protein M được phát hiện trong bộ máy Golgi.

Hình 3: Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của tế bào Vero E6 bị nhiễm SARS-CoV-2 được điều trị bằng kháng huyết thanh SARS-CoV của thỏ [1]. Protein Nsps có thể được tìm thấy gần nhân, trong khi protein M nằm ở bộ máy Golgi. Kháng thể kháng dsRNA được sử dụng để đánh dấu các chất trung gian sao chép trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Nhân tế bào được nhuộm bằng Hoechst. Thanh tỷ lệ là 25 μm cho 3a và 3b và 100 μm cho 3c, 3d và 3e.

Tiềm năng của kính hiển vi huỳnh quang soi thẳng trong nghiên cứu virus học

Kháng huyết thanh phản ứng chéo được mô tả trong nghiên cứu của Ogando et al. [1] là một công cụ hữu ích để mô tả đặc điểm chu kỳ sao chép của SARS-CoV-2. Công cụ này cho phép các nhà nghiên cứu xác định các mục tiêu tiềm năng cho các chất ức chế sao chép.

Một thiết lập thí nghiệm tương đối đơn giản – kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang – là đủ để đưa ra kết luận về chu kỳ nhân lên của virus. Bởi vì đối với phương pháp này, các tế bào được phát triển trên các phiến kính phủ và được gắn trên các phiến kính, nên kính hiển vi huỳnh quang soi thẳng là một giải pháp thiết thực. Phiên bản tự động với bàn soi động cơ kết hợp với trường nhìn rộng (FOV) giúp người dùng có được cái nhìn tổng quan rộng rãi một cách nhanh chóng. Nếu các hình ảnh chụp đơn lẻ là đủ thì bàn soi cơ học vận hành thủ công là lựa chọn hợp lý hơn.

Tham khảo

[1]. N.S. Ogando, T.J. Dalebout, J.C. Zevenhoven-Dobbe, R.W.A.L. Limpens, Y. van der Meer, L. Caly, J. Druce, J.J.C. de Vries, M. Kikkert, M. Bárcena, I. Sidorov, E.J. Snijder, SARS-coronavirus-2 replication in Vero E6 cells: replication kinetics, rapid adaptation and cytopathology, Journal of General Virology (2020) vol. 101, iss. 9, pp. 925-940, DOI: 10.1099/jgv.0.001453.

[2]. L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

Link bài viết gốc: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/life-science/studying-virus-replication-with-fluorescence-microscopy/

DKSH là đơn vị phân phối chính hãng các dòng thiết bị kính hiển vi Leica tại thị trường Việt Nam. 

Tìm hiểu thêm các sản phẩm kính hiển vi Leica tại đây. 

 Leica Microsystems phát triển và sản xuất kính hiển vi và dụng cụ khoa học để phân tích các cấu trúc vi mô và cấu trúc nano. Được công nhận về độ chính xác quang học và công nghệ tiên tiến, Leica Microsystems là một trong những công ty dẫn đầu thị trường về kính hiển vi phức hợp và soi nổi, kính hiển vi soi ngược, kính hiển vi kỹ thuật số, kính hiển vi laser đồng tiêu và kính hiển vi siêu phân giải với các hệ thống hình ảnh liên quan, kính hiển vi điện tử và kính hiển vi phẫu thuật.

Cần hỗ trợ thêm thông tin, Quý khách vui lòng liên hệ:

Phòng Marketing, DKSH

📞 Điện thoại: (+84) 906 654 815

✉ Email: tecinfo.vn@dksh.com

Hoặc để lại thông tin như form bên dưới: